浙江省的主要城市為攻擊目標。
作戰方法是用飛機散佈菌液和空投感染鼠疫的跳蚤。
7月25日，日本關東軍釋出了“關作令＇關東軍作戰命令＇丙第659號”。
8月6日，一列重兵押送的火車從731部隊的平房出發，開往杭州。火車上裝著“空投炸彈700發、汽車20輛，70公斤傷寒菌、50公斤霍亂菌和5公斤鼠疫跳蚤”。
這是一支輕裝前行的特別行動隊。由石井四郞只帶了100個隊員，前往杭州和南京1644細菌部隊的20名隊員匯合。石井四郞是行動的總負責人。
日軍的戰略目的非常明確。其中，寧波是中國東南部重要的港口城市，是蔣介石的家鄉，1940年寧波有26萬人口，水陸交通發達。抗日戰爭期間，寧波港承擔著外援物資進口任務，戰略地位極其重要。衢州和金華縣是從浙江通往江西的浙贛鐵路上的要地。1935年，國民政府在衢州東建成衢州機場，後又經兩次擴建，衢州機場成為中國東南各省中最大的軍用機場。抗戰爆發後，國民政府航空委員會在衢州設立空軍第十三總站，下轄三個機場。衢州城內也是重要的駐兵之地。日軍在此實施細菌戰的目的，就是要切斷中國從寧波港口進來的國外戰爭物資援助，切斷中國的鐵路運輸動脈。
9月18日攻擊開始， 浙江省的寧波、金華、溫州、台州、玉山、衢州等六個城市遭到了細菌攻擊。攻擊直到11月25日才結束。日軍陸軍參謀總長杉山元對###派遣軍和關東軍釋出了“大陸指第781號”命令，下達了於11月末結束作戰的指令。
在長達三個多月的細菌攻擊中，寧波等六地受到了反覆的多種形式的細菌攻擊，這正是石井和他的研究人員反覆實驗過的方法，這一次在實戰攻擊中都用到了。在衢州，特別行動隊採取的是投撒帶菌的麥子和穀粒；在寧波，採取的是在寧波城內或周圍撒播帶菌的穀物和棉絮；在金華，731部隊的飛機在縣城扔下炸彈，炸彈撞擊地面爆炸後施放出一股淡黃色的煙；在玉山，石井實施了在普通居民中施放細菌的計劃，他們把病原體投入居民的水池、水井裡，甚至將幾百個做成米糕的甜點心、水果等放在居民的門口、樹旁，做出一副日軍匆匆離去遺忘了的樣子，騙取當地缺少糧食的居民食用，而這些“食品”裡都注入了大量的傷寒和副傷寒菌。而石井的研究者也得出結論：“這種方法對於副傷寒是最有效的”。
就目前已知的情況，日軍從1940年開始直到1945年戰敗，一直都在進行著對中國的細菌戰攻擊。
1941年9月，日軍陸軍參謀總長再次釋出“大陸指”，對洞庭湖附近的湖南常德進行細菌戰。常德是中國的重要交通樞紐和商業中心，這一次命令要求以造成常德居民間鼠疫流行的方式阻斷中國軍隊的交通。這次參戰的還是731部隊和1644部隊。參加作戰人員的總數約100名。
11月4日晨5點30分， 731部隊航空班的增田美保駕駛九七式輕型轟炸機從江西南昌機場起飛，6點50分到達常德。但是這一天常德“大霧”，於是增田美保只好降低高度。飛機的兩個機翼下面，攜帶著兩個盒子，裡面裝的是鼠疫跳蚤。
事情沒有預想的順利，飛機一側盒子未完全開啟，掉在了洞庭湖裡，飛機另一側的盒子則完全開啟，“穀子36公斤”撒在了常德。“穀子”是鼠疫跳蚤的秘密代號。
後來發現的《井本日記》清楚地顯示了這次攻擊的結果：“11月6日，常德附近出現中毒流行。11月20日前後，出現來勢兇猛的‘鼠疫’流行”。
日軍根據收集的情報認為攻擊獲得極大的成功，中國派遣高階參謀宮野下年大佐提供的報告是：“以常德為中心的‘鼠疫’極為猖獗”。於是部隊士氣高漲，對“圓木”（用於細菌實驗的中國人）極有信心，主要的細菌武器也首選鼠疫，並希望獲得30萬隻老鼠，以增加鼠疫的產量。
1942年4月18日，從太平洋航空母艦上起飛的美軍轟炸機首次空襲了日本本土，這是第一次有人將炸彈扔在日本的本土上，這給日軍的信心以致命的打擊。因為美軍飛機在攻擊日本本土後預定在中國浙江省的城市著陸，於是日軍便向中國進行反撲。這一次使用的還是細菌戰。
關東軍司令部命令，派了一個約100人的遠征隊，帶著細菌前往華東的浙贛戰區。而在731部隊，石井命令生產部製備了約130公斤副傷寒菌和炭疽熱菌，供該遠征隊使用。另外還帶上了大量的霍亂菌和鼠疫菌，其他的所需